CRISPR-teknikken som næste generations gen-terapi.
CRISPR/Cas9, herefter forkortet CRISPR, er en molekylærbiologisk teknik, der gør det muligt at foretage ændringer i cellers arvemasse, altså at editere i generne. Metoden tillader, at man meget præcist kan finde et bestemt sted i cellens DNA og her klippe DNA'et over og/eller erstatte det med et veldefineret stykke DNA. Metoden gør det muligt at behandle patienter med sygdomme, der har en genetisk baggrund, og er desuden et fantastisk forskningsværktøj, som tillader studier i laboratoriet af forskellige geners betydning for cellers vækst og funktion.
Geneditering med CRISPR er én af en række beslægtede, men dog forskellige, teknikker, som har det til fælles, at de giver mulighed for at introducere en præcis ændring af en forudbestemt position i arvemassen, altså at «gen-editere». CRISPR-teknikken adskiller sig fra tidligere metoder ved, at den i udgangspunktet er let tilgængelig, er billig og bygger på et relativt simpelt (enkelt) princip. I det følgende vil der blive gjort kort rede for udviklingen af CRISPR, hvorfor teknikken kom til at revolutionere forskningen inden for alle grene af «life science» (livsvitenskap) og det potentiale, CRISPR-teknikken giver håb for som næste generations genterapeutiske behandling af patienter med genetiske sygdomme.
Det har længe været et stort ønske blandt forskere at kunne foretage kontrollerede og specifikke ændringer i cellers arvemasse for derved at kunne studere og helbrede sygdomme. Et synligt bevis herpå er, at flere af de sidste mange årtiers Nobelpriser er givet til forskere for udvikling i sådanne metoder (1) og senest i år for udvikling af CRISPR til editering af gener. (https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020/press-release/).
CRISPR, som står for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, er betegnelsen for et bakterielt genområde, som koder for de komponenter, der bruges til præcist at udføre ændringer i cellers arvemasse. Før opdagelsen af CRISPR havde metoderne til geneditering været behæftet med manglende præcision og/eller anvendelse af meget ressourcekrævende procedurer. Dette ændrede sig med udviklingen af de såkaldte «nuklease-baserede» genediteringsteknikker; zinc fingers (ZFN), transcription activator-like effector nucleases (TALEN) og Meganuklease sidst i 1990'erne (2). Disse nukleaser er enzymer, der klipper DNA-strengen over, hvorved de ligesom CRISPR forårsager dobbeltstrengsbrud (begge de to DNA-strenge, som arvemassens DNA består af, klippes over) på et forudbestemt sted i arvemassen (figur 1). Vi kan som forskere udnytte de fire før nævnte (ZFN, TALEN, Meganukleaser og CRISPR) molekylære gensakse til at «klippe» et specifikt sted i DNA'et i celler. Metoderne giver herved forskere mulighed for at designe deres gensaks til at klippe på et forudbestemt sted i genomet, hvorved man effektivt og præcist kan ændre, fjerne eller indsætte DNA-sekvenser i cellers arvemasse. Endvidere har alle førnævnte gen-editeringsteknikker vist sig anvendelige på hele organismer af forskellig oprindelse, lige fra planter, insekter og fisk til mennesker (3- 6). Grundet CRISPR's simple (enkle) virkemekanisme stilles der særligt store forhåbninger til teknologiens anvendelse i genterapeutiske sammenhænge i mennesker (7).
Figur 1. Primære udfald efter CRISPR/Cas9-induceret editering. A: CRISPR/Cas9-editering foregår ved, at Cas9-nukleasen binder sig til gRNA. Når Cas9/gRNA-komplekset overføres eller udtrykkes i celler, dirigeres komplekset via gRNA-sekvensen til et defineret sted i arvemassen, hvor det forårsager et dobbeltstrengsbrud. B: Dobbeltstrengsbruddet er således det primære udfald efter CRISPR/Cas9-editering og repareres af cellens eget reparationsapparat, som overvejende består af non-homologous end joining (NHEJ) eller homology directed repair (HDR). I CRISPR/Cas9-sammenhænge fører NHEJ til fejlagtig reparation, hvor der indsættes eller fjernes DNA i dobbeltstrengsbrudsstedet (såkaldte InDel's), som kan føre til geninaktivering (knockout). C: Ved HDR-medieret editering tilføres celler et stykke»reparations«-donor-DNA sammen med CRISPR/Cas9, som så via de homologe sekvenser (flankerer det med rødt angivne donor-DNA) indsættes i dobbeltstrengsbrudsstedet. (Skabelon = sjablong på norsk)
Hvordan virker CRISPR?
I bakterier bruges CRISPR-systemet som forsvar mod infektion af bakteriofager (en type virus, der angriber bakterier). CRISPR-genregionen i bakteriers arvemasse koder for både de funktionelle nukleaseproteiner, som kan betragtes som molekylære «DNA-sakse», der udøver DNA-klipningen (kaldet Cas-proteiner, forkortelse for CRISPR-associerede proteiner) og de associerede CRISPR RNA-molekyler, som specifikt genkender DNA-positioner i bakteriofagens arvemassen som en slags GPS. Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier (8) beskrev som de første den molekylære virkningsmekanisme for de komponenter, som CRISPR lokus fra bakterien Streptococcus pyogenes koder for. Et af disse er nukleaseproteinet, Cas9, herefter kaldt SpCas9. SpCas9 nukleasen kan klippe i DNA på et selvbestemt sted og er dirigeret af et nuklease-associeret CRISPR RNA-kompleks, som består af et CRISPR RNA (crRNA) molekyle, som specifikt genkender det ønskede genomiske lokus og et transaktiverende CRISPR
